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胆碱酯酶催化活性浓度测量参考

  前 言

  胆碱酯酶(cholinesterase)是催化酰基胆碱水解的一类酶,根据底物及分布部位等特性可将胆碱酯酶分为两大类,一类为乙酰胆碱乙酰水解酶(acetylcholineacetylhydrolase,EC3.1.1.7),又称乙酰胆碱酯酶、真性胆碱酯酶、红细胞胆碱酯酶、胆碱酯酶Ⅰ,主要分布于红细胞表面及神经突触处;另一类为酰基胆碱酰基水解酶(acylcholine acylhydrolase,CHE,EC3.1.1.8),又称丁酰胆碱酯酶、假性胆碱酯酶、血清胆碱酯酶、胆碱酯酶Ⅱ,主要分布于肝脏、胰脏、心脏、脑白质、血清中[1]。

  血清中 CHE 由肝脏合成。胆碱酯酶催化活性被广泛用作肝脏合成功能的诊断指标。当发生有机磷农药中毒及氨基甲酸酯类中毒时,有机磷酸酯及氨基甲酸酯能迅速与胆碱酯酶结合并抑制其催化功能,致使神经接头与突触处的神经递质乙酰胆碱积聚增多,产生毒性效应[2]。虽两种胆碱酯酶在有机磷酸酯和氨基甲酸酯中毒时均受抑制,但 CHE 的灵敏性远高于乙酰胆碱酯酶,在中毒数小时内便可引起血清 CHE 催化活性急速下降[3]。因此临床实验室均以血清 CHE 催化活性浓度作为诊断肝脏疾病及有机磷农药中毒的敏感指标[4-7]。胆碱酯酶催化活性浓度的测量对多种疾病的诊断、风险评估[8、9]、病情及恢复进展的判定具有重要的临床意义。胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法亦指 CHE 催化活性浓度测量参考方法。

  由于各国临床化学协会及学术组织的观点不同,血清 CHE 测量方法存在很大差异,临床实验室间检测结果缺乏可比性,直接导致有限医疗资源的浪费[10]。二十世纪研究证明,酶学测定标准化是解决酶学测量结果准确可比的重要途径。酶学测量标准化的工作核心为酶学参考系统的建立及应用。参考系统由参考方法、参考实验室、参考物质组成。截至 2013 年底,国际临床化学联合会(International Federation of ClinicalChemistry and Laboratory Medicine,IFCC)已公布 ALT 等 7 种血清酶测量参考方法,不包含血清 CHE 参考测量方法,表明国际尚无公认的 CHE 测量参考方法[11]。基于血清 CHE 测量对医学诊断的重要价值,2013 年 5 月 IFCC 会议曾讨论建立血清 CHE测量参考方法的议案,可见国外已经开始重视对血清 CHE 测量参考方法的建立工作。

  ……

  1 材料

  1.1 实验材料

  1.1.1 样本

  收集 2012 年 12 月~2013 年 3 月于北京航天总医院就诊患者单份血清样本,根据检验报告比对及肉眼观察的方法剔除乳糜、溶血及黄疸血清样本,避光冻存于-70℃,根据实验所需样本浓度混匀单份血清后使用。

  ……

  2 方法

  2.1 CHE 测量参考方法建立的技术路线

  CHE 测量候选参考方法建立的技术路线见图 1:

  图 1 CHE 测量参考方法建立的技术路线

  2.2 实验方法

  2.2.1 胆碱酯酶测量参考方法被测量的选择收集近 20 年国内外 CHE 测量方法,其主要为测量酶蛋白质量的质量法及测量酶催化活性浓度的酶催化活性法。已有资料表明[24-25],测量酶蛋白质量的免疫分析法测量速度慢、测量过程复杂,不利于自动化、标准化困难且试剂成本较高,不利于 CHE测量方法的推广。由于一定量的生物基质中仅含有极微量的酶,所以目前各医学实验室通常采用酶催化活性浓度法测量 CHE, 以酶催化活性浓度报告酶的测量结果。酶催化活性浓度的单位“katal”早在 1875 年的“计量公约”下被国际度量衡总会通过[26],成为国际认可的酶催化活性浓度计量单位,这使以酶催化活性浓度为单位报告检测结果的实验室间具有一定程度的可比性,有利于酶学测量标准化。因此,本研究选择“酶催化活性浓度”为 CHE 参考方法的被测量。

  3结果 ……32

  4 讨 论

  临床酶学标准化是目前解决临床酶催化活性测定结果在实验室间、各测量方法间缺乏可比性、互换性以及正常人参考范围混乱的有效途径。自上世纪 70 年代起,IFCC便公布了 GGT、ALT、AST 等酶的催化活性浓度测量参考方法,但至今仍无公认的CHE 催化活性浓度测量参考方法[37]。由于各学术组织及各国临床化学协会观点不同,以及方法学研究实验的结果差异等原因,造成 CHE 催化活性浓度测量方法繁多和参考范围混乱的局面。因此本研究收集近 20 年来 CHE 测量方法文献,分析不同被测量的测量方法,根据其测量方法标准化、自动化的可行性、试剂来源与成本等条件,筛选适合作为测量 CHE 的被测量,并针对筛选的被测量分析其应用最为广泛的几种CHE 测量方法,根据胆碱酯酶测量方法的优越性、测量方法的市场占有率、各测量方法的试剂来源及成本等因素,筛选 CHE 测量参考方法的候选测量原理,并购买相应原理试剂盒进行精密度与线性性能评价,以其中性能良好的检测系统的测量原理为CHE 测量参考方法的测量原理。根据对酶学测量的基础理论、酶学测量参考方法的研究现状、胆碱酯酶催化活性浓度测量的原理和特点的理论研究及单因素实验方法选择 CHE 测量参考方法的测量因素及试剂因素的测量条件,尝试以 RSM 对 CHE 测量方法的关键影响因素进行优化,最终建立 CHE 测量参考方法。

  5 结 论

  成功建立了胆碱酯酶催化活性浓度测量参考方法,并建立了单因素联合响应面分析法的酶催化活性浓度测量方法的研究路径。

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